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细胞组织块培养法
发布时间:2019-05-31   点击次数:49次

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一、目的

 

     学习原代培养方法,从供体取得组织细胞后在体外进行的培养。

 

二、概述

 

     组织块培养法是常用的、简便易行和成功率较高的原代培养方法。可以采用剪切法,即将组织块剪切成小块后,接种于培养瓶,组织小块贴壁24h或更长时间后,细胞就从组织四周游出。但由于在反复剪切和接种过程中对组织块的损伤,并不是每个小块都能长出细胞。用于组织块培养的培养瓶可根据不同细胞生长的需要作适当处理,如预先涂以胶原薄层,以利于上皮样细胞等的生长。(本节以新生牛主动脉平滑肌培养为例)

 

三、材料

 

(一)仪器

 

1.净化工作台

2.恒温水浴箱

3.冰箱(4℃、-20℃)

4.倒置相差显微镜

5.培养箱

 

(二)玻璃器皿

 

1.培养皿(Φ100mm)

2.吸管(弯头)

3.烧杯(500ml、200ml、10ml)

4.广口试剂瓶(500ml)

5.玻璃瓶(250ml、100ml)

6.培养瓶

7.废液缸

 

(三)塑料器皿

 

1.吸头

2.枪头

3.胶塞

4.EP管

 

(四)其他物品

 

1.微量加样枪

2.眼科组织剪(直尖、弯)

3.眼科组织镊(直、弯)

4.12.5cm组织镊(无钩、1×2钩)

5.25cm敷料镊(无钩)

6.止血钳(18cm直纹式、12.5cm直纹式、弯纹式)

7.解剖剪

 

(五)试剂

 

1.D-Hanks液

2.小牛血清

3.RPMI1640

4.双抗(青霉素、链霉素)

5.1N HCl

6. 7.4%NaHCO3

 

四、操作步骤

 

1.取材:打开胸腔,无菌操作下取出主动脉胸段,浸到预先配制好的含双抗(500u/ml青、链酶素)的D-Hanks液中漂洗。                                                                                                                               

2.组织的冲洗、修剪:取出主动脉,用锋利的剪刀修剪除去周围组织,再用D-Hanks冲洗主动脉3次,除去血kuai及杂组织等。

3.平滑肌组织分离:纵向剖开主动脉,撕下主动脉内层,取主动脉中层的平滑肌组织,无血清RPMI1640漂洗3次。

4.剪切:将平滑肌组织用锋利的眼科剪反复剪切至剪成1mm3小块,在剪切过程中,可以适当向组织中滴加1~2滴培养液,以保持湿润。

5.贴块:将剪切好的组织小块,用眼科镊送入培养瓶内,用弯头吸管将组织块均匀摆置,每小块间距0.5cm左右,组织块放置好后,轻轻将培养瓶翻转,让瓶底朝上,向瓶内注入适量含10%牛血清培养液,盖好瓶盖。

6.培养:将培养瓶瓶底朝上,37℃培养箱放置2~4h,待组织小块贴附后,将培养瓶慢慢翻转平放,静置培养。

7.换液:原代培养3~5d,需换液一次,去除漂浮的组织块和残留的血细胞。   

      组织块培养法也可不用翻转法,即在摆放组织块后,向培养瓶内仅加入少量培养液,以能保持组织块湿润即可,盖好瓶盖,放置37℃培养箱24h再补加培养液。

 

注意事项

 

1.取材的组织zui好尽快培养。因故不能即时培养,可将组织浸泡于培养液内,放置于冰浴或4℃冰箱中,如果组织块很大,应切成1cm3以下的小块再低温保存,但时间不能超过24h。

2.从消化道、周围有坏死组织等污染因素存在的区域取材,可用含500~1000u/ml的青、链霉素BSS液漂洗5~10min,或用10%达克宁注射液冲洗浸泡10min再作培养。

3. 组织块不易贴壁,可预先在瓶壁涂薄层血清、胎汁或鼠尾胶等。

4. 原代培养的1~2d内要特别注意观察是否有细菌、霉菌的污染,一旦发现,要及时清除。

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