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上海晶抗生物所售单克隆抗体中一般常见筛选方法
发布时间:2019-08-28   点击次数:21次

上海晶抗生物所售单克隆抗体中一般常见筛选方法:

ELISA:酶联免疫吸附实验,通常用间接法。

WB:免疫蛋白印迹。
ICC:免疫细胞化学。
IHC:免疫组织化学。

  单克隆抗体由单一B细胞克隆产生的高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗体,称为单克隆抗体。通常采用杂交瘤技术来制备,杂交瘤(hybridoma)抗体技术是在细胞融合技术的基础上,将具有分泌特异性抗体能力的致敏B细胞和具有无限繁殖能力的骨髓瘤细胞融合为B细胞杂交瘤。用具备这种特性的单个杂交瘤细胞培养成细胞群,可制备针对一种抗原表位的特异性抗体即单克隆抗体。上海晶抗生物根据单克隆抗体实验中细胞融合办法给出具体步骤:欢迎参考!

(一)融合剂
  细胞融合的方法有物理法,如电融合、激光融合,化学融合法和生物融合法,如仙台病毒,此处例举化学融合法中的一种即聚乙二醇融合法。

  聚乙二醇(PEG),在分子量为200~700时,呈无色、无臭的粘稠状液体,分子量大于1 000时,呈乳白色蜡状固体,能溶于水、乙醇及其他许多有机溶剂,对热稳定,与许多化学药品不起作用。用作细胞融合剂的聚乙二醇一般选用分子量为4 000者,常用浓度为50%,pH8.0~pH8.2(用10%NaHCO3调整),分子量小的PEG,融合效应差,又有毒性,分子量过大,则粘性太大,不易操作。50%浓度,pH偏碱时融合效应*。

  也有采用30%~50%浓度的PEG加上10%二甲亚砜。

  不同批号的PEG,即使分子量相同,但融合率却有明显差异,选用时必须注意。每批都必须进行细胞毒性试验后方可应用。要买高纯度的,一般选供气相色谱用的PEG。

(二)融合过程

  融合的方法很多,常用的有转动法和离心法。

  融合时脾细胞和骨髓瘤细胞的比例为1:1至10:1不等。3:1或5:1*为常用。

1.试剂与材料

(1) 供融合用的脾细胞及骨髓瘤细胞。

(2) 1640培养液100ml。

(3) 完全1640液100ml。

(4) 2.5%FCS-1640液50ml。

(5) HAT培养液100ml。

(6) 50%PEG:取分子量4 000,高纯度的(日本进口或Serva)PEG10g放入25ml瓶中高压灭菌,使用前用预热于40℃的1640液10ml等量(W/V)混合,以酚红检查pH,一般不必调pH。如pH有改变,可用HCl或NaHCO3调整。

(7) 10ml和50ml的灭菌沉淀管或瓶。

(8) 40孔塑料培养盘。

2.操作方法

⑴ 准备好脾细胞。

⑵ 在50ml沉淀管中混合108脾细胞和107小鼠骨髓瘤细胞,并加入50ml 2.5%FCS-1640液。

⑶ 室温400g离心3min,使细胞沉淀。

⑷ 移去上清液。

⑸ 轻敲管底部,使沉淀流动,把沉淀管放于40℃水浴中,使其达融合温度。

⑹ 加预热至40℃的50%PEG 0.8ml,用1ml吸管缓慢滴加,边加边摇沉淀管,肉眼观察可见有颗粒出现,滴加过程要求持续2min。

⑺ 加1ml1640液,边加边摇动,持续1min。

⑻重复⑺一次。

⑼ 加1ml 1640液,边加边摇动,持续0.5min。

⑽ 重复⑼一次。

⑾ 加1640液15ml。

⑿ 室温,400g离心1min,使细胞沉淀。

⒀去上清,轻敲管底部,加25ml含有HAT的完全1640液。

⒁ 往已于前一日种有饲养细胞的40孔塑料培养盘中滴加融合的细胞液,每孔1滴(约0.05ml)。

⒂ 轻摇后,放入5%CO2饱和湿度的37℃温箱中培育。

⒃ 第3、6、9、10日换入含HAT的完全1640培养液。注意轻轻吸取上清液,勿将固定于孔底的细胞吸出,根据需要加入适量的饲养细胞。

⒄ 于第12、15日加入含有HAT的完全1640培养液。在每次换液前用倒置显微镜观察,大约在10天左右就可观察到杂交瘤细胞生长出来。大多数杂交瘤细胞在10~20天内出现,但也有在1个月左右才能出现的。杂交瘤细胞出现后,吸取上清液,检查抗体。

⒅ 对继续生长的杂交瘤细胞进行增殖传代。在传代过程中,依情况取消HAT液和完全1640液而代之以10%FCS-1640液。同时保存于液氮和进行克隆化,在这期间每代都要检查抗体,以防止产生抗体细胞的变异和丢失。

(三)细胞融合的关键

1.技术上的误差常常导致融合的失败。例如,供者淋巴细胞没有查到免疫应答。这必然要失败的。

2.融合试验*的失败原因是污染,融合成功的关键是提供一个干净的环境,以及适宜的无菌操作技术。

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